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Gut：Arraystar LncRNA芯片应用于结直肠癌研究

      同济大学附属上海第十医院院长秦环龙教授主要从事胃肠道肿瘤、肠内外营养和肠道微生物的基础与临床研究，近期，其实验室应用Arraystar LncRNA芯片研究发现了一种能调控结直肠癌开展进程的新lncRNA分子——CCAL。CCAL能够跟AP-2α结合，抑制该蛋白活性，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，最终促进结直肠癌的开展进程。该研究成果于2015年刊登在国际胃肠病学顶级期刊Gut（影响因子14.66）上。（芯片实验由LEHU乐虎生物给予技术服务）

研究背景

      结直肠癌（CRC）是常见的恶性肿瘤，90%的早期CRC病人可以顺利获得手术治愈，然而，很多CRC病人诊断出来已是晚期，而且预后很差。化疗常用来治疗晚期CRC病人，但由于缺少预测指标，效果并不令人满意。近几年对CRC的研究虽然已经有了显著进展，但是对CRC致癌的分子机制仍不清楚。lncRNA是一类长度超过200nt的非编码RNA分子。许多研究证明lncRNA可以与癌症相关基因相互作用，在多种肿瘤的开展进程中发挥重要功能。秦环龙教授课题组本次研究的目的在于揭示lncRNA在结直肠癌发生开展过程中的作用。

研究思路

      为了探究LncRNA在结直肠癌发生开展过程中的潜在作用，本次研究应用美国Arraystar Human LncRNA芯片筛选正常结肠癌组织、结直肠腺瘤和结直肠癌中差异表达的lncRNA。其中lncRNA-CCAL在这三种组织中表达量不断升高。之后在252例临床样本中进行CCAL表达丰度的qPCR检测，并顺利获得Cox回归等统计学分析方法研究其临床相关性。发现CCAL的高表达与肿瘤转移、预后不良显著相关并且可以用来预测癌症分期。

      对该lncRNA进行CNC共表达分析，结果表明它与细胞分化、增殖、凋亡和药物抵抗基因密切相关，因此选作重点研究的对象。体外细胞实验和体内裸鼠实验发现，CCAL可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡并调控细胞周期、促进肿瘤的转移和侵袭，证明CCAL是具有重要生物学功能的lncRNA分子。接下来对LncRNA CCAL的上游调控机制进行研究，顺利获得Luciferase实验发现CCAL的promoter区域组蛋白H3甲基化和去乙酰化促进CCAL的表达。

      在CCAL的作用机制研究部分，作者顺利获得RNA pull down、EMSA凝胶迁移实验发现CCAL可以和AP-2α蛋白结合，导致AP-2α蛋白下调；用IP发现AP-2α, APC和β-catenin形成复合物，从而激活Wnt/β-catenin通路，导致β-catenin, c-myc, cyclin D1 和E-cadherin等通路基因表达变化。多药物抵抗MDR是化疗的一个主要障碍，利用药物抵抗细胞系LoVo/5-FU研究发现，CCAL顺利获得激活Wnt通路来调控多药物抵抗相关基因MDR1/P-glycoprotein的表达。


技术路线


结果展示

上图：A：芯片检测中CCAL在恶性、良性肿瘤和正常组织的表达量不断降低；B：qRT-PCR验证中CCAL在恶性、良性肿瘤和正常组织的表达量不断降低，与芯片验证结果相符。

中图：对结直肠癌样品的芯片数据作CNC分析，证明CCAL（ASLNC14812）和1个lncRNA和11个蛋白编码基因表达具有相关性。

下图：C：K-M曲线显示，CCAL高表达与结直肠癌预后不良显著相关；D：CCK8检测细胞增殖，转染后不同时间点不同处理组比较发现，CCAL显著促进细胞增殖。


研究意义

该研究揭示了lncRNA CCAL和Wnt/β-catenin信号通路之间的关系。LncRNA-CCAL顺利获得结合并抑制AP-2α来激活Wnt/β-catenin信号通路，影响肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、凋亡和血管生成，Wnt/β-catenin通路可进一步促进化疗多药物抵抗相关基因MDR1/P-gp的表达量上升，从而影响化疗的多药物抵抗。同时，大量结直肠癌的临床标本研究表明，CCAL的高表达与结直肠癌的预后不良显著相关，为结直肠癌的治疗给予了潜在的靶点和预后生物标记物。